这是一个三期的关于酒花风味物质转化的专题，第一章会探讨酵母对酒花的生物转化，第二章会探讨酶对酒花的转化，第三章将会探讨其他酵母（非 S. cerevisiae）对酒花的转化。
酶并不是陌生的东西。从日常生活而言，例如口水中富含唾液淀粉酶，能把谷物的淀粉转化成糖。在酿酒过程中，α-淀粉酶和β-淀粉酶帮助麦芽汁往不同的方向发展，以扩展啤酒的风味。而在酒花的应用中，酶一定程度上也会起到特殊的作用。
风味物质以及酶介绍
同样地，先介绍下文会用到的词语。
香气物质
- 香叶醇（Geraniol）：甜玫瑰花香。闻味/品尝阈值：4-75ppb/10ppm。
- 香茅醇（Citronellol）：新鲜玫瑰，桃子，柑橘的香气。闻味/品尝阈值：不详。
- 芳樟醇（Linalool）：佛手柑，薰衣草，花香，辛香，木味。闻味/品尝阈值：1ppm/不详。
- 品萜醇（Terpineol/α-Terpineol）：花香，紫丁香花味（与丁香clove区分）。闻味/品尝阈值：280-350ppb/不详。
- 4-品萜醇（4-terpineol）：松香。闻味/品尝阈值：不详。
- 橙花醇（Nerol）：甜玫瑰味，柑橘，草青，青柠味。闻味/品尝阈值：不详。
- 乙酸香叶酯（Geranyl Acetate）：薰衣草、草青味、热带水果的集合味道、后段偏甜。闻味/品尝阈值：9-460ppb/20ppm。
- 乙酸异戊酯（Isoamyl Acetate）：香蕉、甜水果。闻味/品尝阈值：1.1ppm/不详。
- 月桂烯（Myrcene）：柑橘味，甜味。闻味/品尝阈值：不详。
- 1-辛醇（1-Octanol）：橙子、玫瑰香气，尝起来是油感的甜的草本方向。闻味/品尝阈值：不详。
- 1-辛烯-3-醇（1-octen-3-ol）：草药、蘑菇。闻味/品尝阈值：不详。
- 水杨酸甲酯（Methyl Salicylate）：冬青。闻味/品尝阈值：不详。
酶
- 内源性酶（Endogenous Enzymes）：指本身在组织/细胞内本身存在的酶。
- 外源性酶（Exogenous Enzymes）：指从外部引入的酶。
糖苷
- 糖苷（Glycosides）：一类化合物，其中糖经由糖苷键被绑定到另一个官能团。
- 苷元（Aglycon）：是糖苷类化合物中，与糖缩合的非糖部分。
- 葡萄糖苷（Glucoside）：指糖基为葡萄糖的苷类。葡萄糖苷在植物中非常普遍，但在动物中很少出现。
- β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）：用于水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的苷元。有多种β-葡萄糖苷酶。
- 1,3-β-葡聚糖外切酶（exo-1,3-β-glucanse，EXG1)：用于水解1,3-β-葡聚糖苷。
除此之外，介绍一下生物转化的代替品，食品酶：Rapidase系列食品酶。Rapidase是DSM生物科技公司出品的食品酶系列，旗下有很多产品，可以自行去官网了解，主要用于酿水果酒酒，制果汁等方面。其他类似的酶还有Lallemand公司的Lallzymes系列、SocttLab公司的Scottzymes。
酵母的酶
酶存在与各种生物上，酵母也不例外。S. cerevisiae 有771种酶，现今尚不清楚还有哪些酶对酒花有影响，但我们研究的方向会是葡萄糖苷酶。研究表明，酒花里含有一定量的糖苷物质，例如芳樟醇-葡萄糖苷。
糖苷本身无味，但是被绑定在糖苷里的苷元则有可能是重要的香气化合物。假如可以释放出将会提升啤酒的整体香气。遗憾的是，研究表明，只有少数S. cerevisiae酵母菌株显示出β-葡萄糖苷酶的活性，表明绝大部分S. cerevisiae酵母都不具备β-葡萄糖苷酶的产生条件。即使特定的酵母有β-葡萄糖苷酶活性，也会因为葡萄糖溶解度、PH值及酒精度抑制其酶生产速度。而部分Brettanomyces却有很高的β-葡萄糖苷酶的活性，这个就不细说了，毕竟我们并不想在啤酒里带入酸味。
研究表明，S. cerevisiae 酵母里较为活跃的，与糖苷水解相关的是另外一种酶，1,3-β-葡聚糖外切酶（EXG1）。EXG1的主要功能是用于贵腐葡萄酒的酿造过程中，断开葡聚糖苷的连接。EXG1的确对一些葡萄糖苷如：水杨苷（Salicylin）、熊果苷（Arbutin）、对硝基苯-β-D-葡萄糖苷（pNPG）、4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷（4-MUG）等和多糖如：昆布多糖（Laminaria）、纤维二糖（Cellobiose）等有水解作用。报告指出，EXG1在两个不同的实验里，对芳樟醇的释放不一，有可能与实际的发酵条件以及菌株相关。所以，S. cerevisiae酵母的确能够释放葡萄糖苷里的苷元，但这是因为EXG1而不是β-葡萄糖苷酶，尽管如此，EXG1依然不是首选的葡萄糖苷酶，假如能够直接使用β-葡萄糖苷酶将会很好。
食品酶
所以有人想用食品酶参与到发酵过程。从外部引入酶，即外源性酶。既然S. cerevisiae酵母本身没有β-葡萄糖苷酶活性，就尝试外部添加β-葡萄糖苷酶。这不是一个新鲜的方法，在水果酒的酿造过程里，酶均有广泛参与。
但值得留意的是，β-葡萄糖苷酶对糖苷的水解与上述的大部分酒花风味物质无缘。一项研究希望在干投的时候添加β-葡萄糖苷酶以释放被绑定在芳樟醇-葡萄糖苷里的芳樟醇。但该研究发现，在β-葡萄糖苷酶的参与下，最明显改变的反而是1-辛醇，而芳樟醇、香叶醇、品萜醇的变化不大，后面的多个研究也证实这点。
但先不要灰心，酒花本身包含了数百种风味物质，尽管上述的几种风味物质占主导，但不一定会影响其他物质的表现。New belgium曾做了一次实验，干投Cascade酒花后中加入Rapidase Hoptimase食品酶（该酶目前商品信息不明确），包含：β-葡萄糖苷酶以及多聚半乳糖醛酸酶/果胶酶（Polygalacturonase），然后用GC-MS和品鉴去测试有何不同。实际上，在尽管控制组与实验组的烯类化合物和萜类化合物并没有明显的增加，但是在品鉴的过程，风味方面还是有很明显区别。果胶酶是否也对酒花产生影响，New Belgium没有给出答案，但果胶酶很常用于红酒的酿造中，以释放果胶中的果汁和风味。
而另外一个实验，由百威公司的Luk Daenen实验的，在提取出来的Saaz酒花糖苷中使用Rapidase公司的AR2000（现名Revelation Aroma，包含四种由黑曲霉Aspergillus Niger提取出的α及β-葡萄糖苷酶）食品酶。使用该食品酶，然后使用GC-MS观测，分别在不同时间段检测其释放的化合物。从图像上可以看到，检测出来的就有1-辛烯-3-醇，水杨酸甲酯，芳樟醇，萜品醇等。对比New Belgium的实验，AR2000能够带来芳樟醇的提升，有可能得益于其他几种酶的作用。
有一点很有趣。在很多文献中讨论的糖苷中，由1,4-β-葡萄糖键（β-1,4-glycosidic bond）绑定的糖苷尤为多。而能够切割1,4-β-葡萄糖键的酶其实有很多，包括上面提到的β-淀粉酶，β-葡萄糖苷酶等。但酶的作用原理是先识别受体，例如淀粉、糖苷等，再去作用于其糖苷键上。酶在识别受体上就会有选择性地忽略掉与之分子结构不相似的受体，所以这也是β-淀粉酶没有办法作用于β-葡萄糖苷键，也是EXG1能够有限水解糖苷的原因之一。
结论
从这两个实验中，不难发现，不同的食品酶对酒花风味物质的释放有不同程度的帮助，而释放的物质并不局限传统上我们讲的酒花风味物质，而是会有其他一些尚未查明的风味物质。而β-葡萄糖苷酶的潜能不仅于此，同时引入其他酶可能会有更大的惊喜。当然，这个还需要更多的摸索，但其实酶不是一个便宜的东西，所以经济条件尚可的，可以尝试购买试试。
最后感谢中山大学医学院的孟映彤对本文的指导以及论文资源提供。
参考文献：
Glycosides
http://www.milkthefunk.com/wiki/Glycosides
Unlocking Hop and Fruit Flavors from Glycosides
https://www.homebrewtalk.com/unlocking-hop-and-fruit-flavors-from-glycosides.html
Beta-glucosidase
https://en.wikipedia.org/wiki/Beta-glucosidase
AR 2000
《De novo synthesis of monoterpenes by Saccharomyces cerevisiae wine yeasts》
《Characterization of Recombinant Yeast Exo-β-1,3- Glucanase (Exg 1p) Expressed in Escherichia coli Cells》
《Use of beta-glucosidase activity for flavour enhancement in specialty beers》
《Biotransformation of Hop-Derived Monoterpene Alcohols by Lager Yeast and Their Contribution to the Flavor of Hopped Beer》
《Optimizing hop aroma in beer dry hopped with Cascade utilizing glycosidic enzymes》
《Screening and evaluation of the glucoside hydrolase activity in Saccharomyces and Brettanomyces brewing yeasts》
《The effect of hopping regime, cultivar and β- glucosidase activity on monoterpene alcohol concentrations in wort and beer》
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